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O PCR é um teste que tem sido usado no diagnóstico de muitas doenças. O método de PCR permite mostrar a presença direta da bactéria no organismo e, especificamente, seu DNA. O teste de PCR é usado, entre outros no diagnóstico da doença de Lyme. Qual é a técnica de PCR? O que é PCR em tempo real?
Índice:
- PCR (teste) - qual é a técnica de PCR?
- PCR (pesquisa) - aplicação do método PCR
- PCR (pesquisa) - doença de Lyme
- PCR (pesquisa) - resultados. Eles podem ser falsos positivos?
- PCR (pesquisa) - resultados. Eles podem ser falsos negativos
PCR (reação em cadeia da polimerase) é o método básico usado em laboratórios genéticos e moleculares. Foi desenvolvido em 1983 por Kara Mullis, que recebeu o Prêmio Nobel em 1993 por ele.
Ouça o que é a técnica de PCR. Este é o material do ciclo ESCUTAR BOM. Podcasts com dicas.
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PCR (teste) - qual é a técnica de PCR?
O teste de PCR consiste na amplificação múltipla (geralmente em 30-40 ciclos) de um fragmento de DNA específico, por exemplo, genes que codificam proteínas Borrelia, com o uso da enzima polimerase.
Então, corantes moleculares especiais são usados para tornar visível o fragmento de DNA amplificado. A PCR, devido à amplificação de fragmentos específicos de DNA, é um método ultrassensível.
No método de PCR, fragmentos de DNA são amplificados com pares de primers específicos para uma determinada região do DNA bacteriano. Por exemplo, as regiões alvo em PCR utilizadas no diagnóstico da doença de Lyme são genes que codificam proteínas, e. 16S rDNA, recA, fla, p66, OspA.
O material biológico a partir do qual o teste pode ser realizado é:
- sangue
- uma seção de pele de um eritema migratório
- líquido cefalorraquidiano
- líquido sinovial ou da cartilagem articular
- urina
PCR (pesquisa) - aplicação do método PCR
Além do diagnóstico da borreliose de Lyme pelo método de PCR, é possível detectar fragmentos de DNA específicos de outros microrganismos ou humanos. Portanto, o método de PCR também é usado em:
- diagnóstico e monitoramento de infecções virais: vírus do herpes (herpes, herpes zoster, Epstein-Barr, citomegalovírus), HIV, vírus da hepatite (HBV e HCV)
- diagnóstico e monitoramento de infecções bacterianas, especialmente aquelas bactérias que não podem ser identificadas por meio de culturas, por exemplo, tuberculose
- diagnóstico e monitoramento de doenças neoplásicas: leucemia, câncer de mama, câncer colorretal, câncer de pulmão
- diagnóstico de predisposição ao câncer: câncer de mama e ovário (genes BRCA1 e BRCA2), câncer colorretal (genes APC e CHEK2)
- diagnóstico de doenças genéticas: hemocromatose (gene HFE), talassemia (genes HBA1 e HBA2), doença celíaca (genes HLA)
- testes de paternidade, que detectam a compatibilidade do DNA da criança e do pai
Atualmente, existem muitas modificações no método de PCR. Por exemplo, no diagnóstico da borreliose de Lyme, os métodos de nested PCR e PCR em tempo real são usados principalmente. Este último é um método quantitativo e permite a determinação do número exato de cópias de DNA de Borrelia no material biológico testado.
PCR (pesquisa) e doença de Lyme
Os testes sorológicos são a base para o diagnóstico da doença de Lyme. No entanto, existem situações clínicas que podem fazer com que esses testes sejam falsos negativos:
- janela serológica, ou seja, o período inicial de infecção em que o corpo ainda não produz anticorpos IgM e IgG específicos contra espiroquetas Borrelia
- em pessoas com imunodeficiência que não produzem anticorpos suficientes
- a presença de imunocomplexos que consistem em antígenos Borrelia e anticorpos específicos para eles, e prevenir a detecção de anticorpos por métodos sorológicos
Se houver suspeita de sintomas da doença de Lyme no paciente e os resultados do teste sorológico forem negativos, o teste molecular com base no método de PCR pode ser realizado.
O DNA das espiroquetas Borrelia pode ser detectado no estágio inicial da infecção, pois o número de espiroquetas nos fluidos corporais é então o mais alto.
No diagnóstico da borreliose de Lyme, métodos sorológicos como ELISA são usados principalmente, mas em algumas situações clínicas os testes genéticos usando o método de PCR são úteis.
Quanto maior o tempo decorrido desde a infecção, menor é a probabilidade de detectar o DNA bacteriano. Portanto, em alguns casos, antes da realização do teste de PCR, as bactérias são cultivadas em meios especiais por 1-2 semanas e então o teste é realizado.
Essa abordagem é usada em caso de suspeita de doença de Lyme e líquido cefalorraquidiano colhido. Na fase tardia da infecção, é mais apropriado realizar um teste ELISA.
O método de PCR não deve ser usado no diagnóstico de rotina da borreliose de Lyme devido à falta de padronização quanto à ocorrência de variedades de Borrelia burgdorferi na Polônia.
Porém, em caso de dificuldades no diagnóstico (principalmente na fase inicial da doença), o resultado do teste de PCR auxilia no processo diagnóstico.
Um resultado de teste positivo significa que a presença de DNA de Borrelia burgdorferi e suas variedades foi detectada no material testado, mas não explica se uma infecção ativa está ocorrendo no corpo. Por outro lado, um resultado negativo não exclui a presença de bactérias no corpo.
Alguns laboratórios oferecem testes para a presença de DNA de Borrelia no carrapato. No entanto, o resultado de tal exame não é a base para o diagnóstico da doença de Lyme em uma pessoa picada.
Artigo recomendado:
Teste ELISA - o que ele detecta? Como ler os resultados? Preço do testePCR - resultados. Eles podem ser falsos positivos?
O PCR é um método ultrassensível e ao mesmo tempo muito sensível à contaminação. Portanto, é muito importante em testes baseados em PCR selecionar um controle interno apropriado para descartar falsos positivos.
A chave é também a coleta correta de material para teste, bem como a experiência e confiabilidade do diagnosticador que realiza o teste.
PCR - resultados. Eles podem ser falsos negativos
Como em qualquer teste de laboratório, também no método de PCR podem aparecer resultados falsos negativos. Aqui é crucial coletar sangue para um anticoagulante apropriado, pois alguns deles, como a heparina, podem inibir a reação de PCR.
Além disso, a coleta do material após o início da antibioticoterapia pode causar uma diminuição na eficiência da reação de PCR e uma maior probabilidade de resultados falsos negativos.
Também deve ser lembrado que a bactéria Borrelia vive por um período muito curto no sangue e nos fluidos corporais, porque graças a receptores especiais, elas penetram muito rapidamente em locais "difíceis de alcançar" do corpo.
Portanto, ao contrário do diagnóstico de outros microrganismos, o número de espiroquetas Borrelia no material biológico é pequeno, às vezes até no limite de detecção do método de PCR. Isso também pode causar um falso negativo.
Artigo recomendado:
Teste de transformação de linfócitos (LTT)Literatura
- Dunaj J. et al., A importância do método PCR no diagnóstico da borreliose de Lyme. Squeaky toy Epidemiol. 2013, 67, 119 - 123.
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